當凍干工藝放大過(guò)程中遭遇過(guò)冷度難題，該如何解決？

1、預凍及成核

凍干過(guò)程分為三個(gè)主要階段：

● 預凍

● 主干燥（一次干燥）

● 次級干燥（二次干燥）

預凍階段主要是樣品中的溶劑（多數情況下是水）凝固，形成冰，從溶質(zhì)中分離出來(lái)；主干燥階段主要是將預凍階段形成的冰通過(guò)升華的方式去除，也是整個(gè)凍干過(guò)程中最 長(cháng)的一個(gè)階段；次級干燥是利用擴散和解吸附的原理進(jìn)一步去除未凍結的水分。

第 一 步的預凍盡管時(shí)間相對來(lái)說(shuō)不是很長(cháng)，但是很關(guān)鍵，因為：

1. 它決定了樣品的形態(tài)，進(jìn)而決定一次干燥和二次干燥產(chǎn)品的性能；

2. 極大地影響產(chǎn)品的物理化學(xué)性質(zhì)（如成分的結晶）；

3. 對API施加了不穩定的應力（如冷凍濃縮影響）。

預凍過(guò)程中產(chǎn)品溫度隨時(shí)間的變化，如圖1：

圖1：預凍過(guò)程產(chǎn)品溫度隨時(shí)間變化圖

1--層板進(jìn)口溫度（降溫速率0.5℃/min）

2--成核之前樣品溫度（降溫速率約0.3℃/min）

3--成核溫度Tn: 初次形成冰核的溫度

4-平衡凝固點(diǎn)Tf

* Tn和Tf之間樣品處于過(guò)冷狀態(tài)

Q：液體的水是如何變?yōu)楣腆w的冰？

1. 一次成核：最初的晶核出現在超過(guò)臨界尺寸的分子團簇中；

2. 二次成核：冰核向冰晶的生長(cháng)（“結晶”）；結晶的放熱事件停止了二次成核；

3. 最終固化：通過(guò)層板冷卻的小瓶底部向頂部行進(jìn)，是一個(gè)緩慢的過(guò)程，熱量必須通過(guò)已經(jīng)固化的基質(zhì)和小瓶的底部傳遞到層板，當繼續冷凍濃縮，直到達到Tg’，玻璃態(tài)的高粘度基質(zhì)阻止了水的進(jìn)一步結晶。

在這個(gè)過(guò)程中我們通常會(huì )面臨一個(gè)問(wèn)題，一次成核是一個(gè)隨機和自發(fā)的過(guò)程，整個(gè)批次樣品的成核會(huì )發(fā)生在一定的溫度和時(shí)間范圍內（樣品成核溫度相差約9.1℃，全部成核經(jīng)歷的時(shí)間大約47min）（見(jiàn)圖2），這種不同跟樣品所處的環(huán)境條件以及降溫速率有關(guān)。

圖2：同一批次樣品成核溫度和時(shí)間關(guān)系圖

50 mg/mL Sucrose; 10 mL Vial; 3 mL Fill Volume

這種隨機的不受控制的自發(fā)過(guò)程會(huì )導致：

1. 同一批次中不同小瓶的成核溫度不同，最 終干燥產(chǎn)品性能的異質(zhì)性；

2. 實(shí)驗室（非GMP）和無(wú)菌中試或生產(chǎn)規模之間成核溫度的批次可變性；

3. 兩種可變性都會(huì )影響產(chǎn)品和工藝性能；

4. 過(guò)程控制問(wèn)題（一次干燥終點(diǎn)指示）；

5. 產(chǎn)品質(zhì)量面臨風(fēng)險（一批產(chǎn)品中不同的初次干燥時(shí)間?。?/span>

6. 放大：成核溫度降低1°C（較低的過(guò)冷度），初級干燥時(shí)間縮短約3%。這種預凍行為的可變性是工藝放大化轉移面臨的一個(gè)嚴重的問(wèn)題，通常我們可以通過(guò)退火來(lái)改善同一批次樣品的孔徑大小分布，來(lái)減少批次內和批次之間冰晶形態(tài)的差異，提高樣品的均一性。退火是一種比較成熟并且已被普遍接受和認可的用于凍干過(guò)程中改產(chǎn)產(chǎn)品均一性的一種方法，最 佳的退火溫度（在樣品的Tg’和Te之間）和時(shí)間（幾小時(shí)到6h不等）也需要根據不同的配方產(chǎn)品進(jìn)行摸索來(lái)決定，然而，退火也并不是適用于所有的樣品，有些時(shí)候，退火可能反而會(huì )起到不好的作用，如加劇產(chǎn)品的降解，因此需要對具體的工藝及儲存穩定性進(jìn)行詳細的研究，退火也需要謹慎使用。

Q:那么是否有新的技術(shù)或方法能夠直接控制成核溫度來(lái)改善這種差異性呢？什么是控制？

A:控制就是要有使產(chǎn)品能夠在指 定的溫度和時(shí)間下完成成核的能力。

2、成核控制技術(shù)種類(lèi)

針對目前存在的以上問(wèn)題，科學(xué)家門(mén)研究出了各種不同的成核控制技術(shù)：

添加成核種子或小瓶預處理誘導成核

使用添加劑（例如碘化銀/丁香假單胞菌）或小瓶預處理（刻劃、刮擦或表面粗糙化）以產(chǎn)生額外的成核位點(diǎn)，從而促進(jìn)晶核的形成。

● 不適用于生產(chǎn)凍干腸外產(chǎn)品（無(wú)菌/顆粒物?。?/span>

● 沒(méi)有Tn的“控制”

● 只是提高了平均的成核溫度

電誘導成核

通過(guò)強電脈沖（U=3 kV）誘導成核；

需要一個(gè)與產(chǎn)品直接接觸的電極；

不能直接用于含有大量鹽（如NaCl）的溶液。

超聲波誘導成核

在過(guò)冷（亞穩）系統中使用振動(dòng)誘導成核（聲脈沖：10 ms，10–40 kHz）；

沒(méi)有大規模應用的報告。

真空誘導表面凍結成核

通過(guò)將腔室壓力降低至稍低于大氣壓（約1mbar），并在約-10℃下預先平衡液體產(chǎn)品來(lái)誘導表面凍結；

過(guò)度沸騰的風(fēng)險（產(chǎn)品外觀(guān)損害、產(chǎn)品損失）。

冰霧誘導成核

將產(chǎn)品冷卻至低于Tf（例如-5℃）的所需成核溫度并平衡一定時(shí)間，然后降低腔室壓力至中等負壓（約50Torr），將冷氮氣注入腔室，冰霧（微小冰晶）遷移到小瓶中誘導成核。冰霧成核的方法可用在實(shí)驗室及生產(chǎn)規模的凍干設備上，但是需要考慮無(wú)菌的問(wèn)題，冰霧分布的均一性以及是否能夠實(shí)現瞬時(shí)成核。

加壓卸壓法誘導成核

采用加壓瞬間卸壓的方法，當加壓到一定壓力，降低層板溫度至期望的成核溫度，維持一定時(shí)間，瞬間降壓的同時(shí)成核，壓力調節采用無(wú)菌的惰性氣體，無(wú)任何污染源引入到腔體中，在中試以及生產(chǎn)型凍干機上均可實(shí)現。

具體的機理，目前有幾種假說(shuō)：

1. 產(chǎn)品腔體中的氣體在卸壓的過(guò)程中經(jīng)歷了膨脹會(huì )冷卻，冷卻的氣體接觸到亞穩態(tài)的液體樣品表面，誘導成核；

2. 卸壓會(huì )引起樣品液體表面的局部蒸發(fā)，蒸發(fā)導致的冷卻誘導成核；

3. 突然的卸壓可能會(huì )產(chǎn)生壓力波或震動(dòng)干擾，從而誘導成核；

這種方法可以使整批樣品在瞬間成核（幾秒的時(shí)間），形成高度均勻的冰晶尺寸，但是需要耐壓的產(chǎn)品腔才可以實(shí)現，并且價(jià)格昂貴。

各種成核技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，不管是哪種成核技術(shù)，應用在制藥行業(yè)，首先需要維持產(chǎn)品的無(wú)菌性，系統的完整性，另外需要考慮其適用性、有效性，針對具體產(chǎn)品的價(jià)值性等。

3、成核控制技術(shù)案例分享

材料和方法

實(shí)驗目的

采用成核控制、傳統退火程序和隨機成核三種方法用于產(chǎn)品性能和關(guān)鍵指標以及凍干工藝優(yōu)化潛力的比較。

實(shí)驗設計

對于工藝1-4，二次干燥程序均為0.1℃/min升溫至40℃, 維持360 min；一次干燥真空度均為57mTorr; 一次干燥終點(diǎn)判斷壓力靈敏度 1mTorr(Pice和Pc差值)。

實(shí)驗結果圖

圖3：不同工藝產(chǎn)品內部結構圖 

圖4：不同工藝產(chǎn)品一次升華干燥阻力數據圖

圖5 不同工藝一次干燥產(chǎn)品升華界面溫度數據圖

圖6：不同工藝一次干燥產(chǎn)品底部溫度數據圖

圖7 ：不同工藝產(chǎn)品一次干燥時(shí)間圖

圖8 ：不同工藝產(chǎn)品最 終水分含量數據

根據實(shí)驗數據結果得出如下結論

●   在較高的溫度下成核，能夠獲得更大尺寸的內部孔徑結構（圖3）；

●   經(jīng)過(guò)成核控制或退火處理，在一次升華過(guò)程中具有較小的升華阻力（圖4）；

●   成核控制或退火處理檢測到的產(chǎn)品升華界面的溫度較低，這是由于升華阻力較小導致的，這樣可以設置更高的層板溫度，進(jìn)而提高升華速率，縮短干燥時(shí)間（圖5）；

●   在主干燥過(guò)程中，使用熱電偶產(chǎn)品溫度探頭檢測到的產(chǎn)品溫度中，成核控制或退火處理獲得的產(chǎn)品溫度較低（圖6）；

●   成核控制可以縮短一次干燥的時(shí)間（圖7）；

●   成核控制能夠獲得較大的冰晶結構，有利于一次干燥，但是反過(guò)來(lái)產(chǎn)品具有較小的比表面積，不利于二次干燥水分的去除，因此具有相對高的殘留水分，需要調整二次干燥的條件來(lái)優(yōu)化（圖8）。

4、總結

成核控制除了能夠提高凍干效率，改善產(chǎn)品均一性外，經(jīng)過(guò)研究發(fā)現，它還在改善某些產(chǎn)品的性能及外觀(guān)方面具有良好的效果，如解決產(chǎn)品表面結殼，產(chǎn)品開(kāi)裂或萎縮，裂瓶，縮短復水時(shí)間，提高產(chǎn)品穩定性等，成核控制技術(shù)對于凍干工藝及產(chǎn)品的潛在優(yōu)勢也在不斷地探索和進(jìn)一步研究中，最 終的效果可以根據不同的樣品通過(guò)具體的實(shí)驗來(lái)驗證。

5、成核控制凍干設備

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Controlyo®控制成核技術(shù)

在相同的溫度下，以瞬間減壓的方式在同一時(shí)間讓所有小瓶瞬間成核，在較高的溫度下成核，產(chǎn)生更大、更均勻的晶體尺寸，使干燥更加一致。

●  提高批次均勻性；

●  無(wú)引入污染或外來(lái)物質(zhì)的風(fēng)險；

●  增加凍干產(chǎn)品的蒸汽通道尺寸，進(jìn)而減少干燥層的阻力；

●  加快主干燥過(guò)程；

●  減少產(chǎn)品復水時(shí)間；

●  改善凍干產(chǎn)品的外觀(guān)。

萊奧德創(chuàng )凍干工場(chǎng)

上海萊奧德創(chuàng )生物科技有限公司由德祥科技有限公司創(chuàng )辦，專(zhuān)注于提供高品質(zhì)的凍干設備應用和制劑開(kāi)發(fā)相關(guān)服務(wù)。

德祥科技有限公司服務(wù)凍干行業(yè)十余年，在涉及冷凍干燥領(lǐng)域的工藝開(kāi)發(fā)/工藝優(yōu)化/商業(yè)化等各方面擁有豐富的經(jīng)驗，迄今為止已為500+客戶(hù)提供凍干設備及相關(guān)服務(wù)?？蛻?hù)產(chǎn)品類(lèi)型涵蓋：蛋白、抗體、ADC、疫苗、核酸、多腦、脂質(zhì)體、IVD、食品等領(lǐng)域。依托于合作伙伴美國ATS SP Scientific和英國Biopharma Group的緊密合作，掌握前沿的凍干理念與技術(shù)，使用高品質(zhì)的凍干設備和軟件致力于促進(jìn)中國生物醫藥技術(shù)創(chuàng )新升級，助力中國大健康行業(yè)的持續發(fā)展。

Our Mission

萊奧德創(chuàng )凍干工場(chǎng)專(zhuān)注于提供高品質(zhì)的凍干設備應用和制劑開(kāi)發(fā)相關(guān)服務(wù)，致力于促進(jìn)中國生物醫藥技術(shù)創(chuàng )新升級，助力中國大健康行業(yè)的持續發(fā)展。 

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