6月15日，蓋茨基金會(huì )聯(lián)席主席比爾?蓋茨在京訪(fǎng)問(wèn) GHDDI，并發(fā)表題為“以創(chuàng )新之力，應對全球挑戰”的主旨演講，并表示：“mRNA 疫苗技術(shù)使預防結核病和瘧疾等疾病的疫苗成為可能。”mRNA疫苗的發(fā)展也得益于凍干技術(shù)這一領(lǐng)域的突破性應用。

（來(lái)源：“以創(chuàng )新之力，應對全球挑戰”的主旨演講）

疫苗可以說(shuō)仍是mRNA賽道上目前最主要的一大研發(fā)方向，而在此之外，逐漸成熟的mRNA技術(shù)也被應用于其他藥物領(lǐng)域，包括細胞與基因治療、抗體藥物、蛋白替代療法等，

具體如下：

mRNA技術(shù)核心離不開(kāi)納米顆粒

預防傳染性疾病絕不是mRNA的全部使命，用mRNA技術(shù)攻克腫瘤才是各大巨頭接下來(lái)的主戰場(chǎng)。mRNA技術(shù)正在向各個(gè)領(lǐng)域滲透，帶來(lái)新的變革。作為mRNA技術(shù)核心的藥物遞送系統繞不開(kāi)納米顆粒。

美國國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì )(NSTC)早在2000年啟動(dòng)了國家納米技術(shù)計劃(NNI)，并為該領(lǐng)域提出了明確的計劃和重大挑戰，納米顆粒(nanoparticles)占據了該計劃的很大一部分。納米顆?？梢蕴岣弑环庋b貨物的穩定性和溶解度，促進(jìn)跨膜運輸，延長(cháng)循環(huán)時(shí)間，從而提高安全性和有效性。由于這些原因，納米顆粒的研究已經(jīng)被廣泛應用在癌癥醫學(xué)、免疫治療和體內基因編輯中。

納米顆粒遞送mRNA用于蛋白質(zhì)替代療法、基因組編輯和mRNA疫苗（參考資料1）[1]

納米顆粒極其多樣化，從固體脂質(zhì)結構到脂質(zhì)體，甚至是包含金/二氧化硅顆粒的設計。納米顆粒最近的作用之一是提供癌癥治療的藥物。它們的復雜的結構通常是基于核殼的，藥物被納米顆粒包裹并運輸到全身。這些藥物可以直接指向身體的特定區域，降低毒性，提高藥物的有效性。使用脂質(zhì)納米顆粒 (LNPs) 包裹SARS- CoV-2 mRNA，作為最近開(kāi)發(fā)的幾種COVID疫苗的基礎。

大多數納米顆粒配方都是在溶液中，尺寸分布不均。這些納米懸浮液可能是不穩定的，并受到沉降、團聚、晶體生長(cháng)或化學(xué)反應等問(wèn)題的影響。凍干可以增加這些顆粒的穩定性，這也有利于在其中加入的藥品的穩定性。

美國康涅狄格大學(xué)Xiuling Lu博士對此曾進(jìn)行了一場(chǎng)網(wǎng)絡(luò )研討會(huì )專(zhuān)題演講并描述了冷凍干燥納米顆粒的挑戰以及如何與Robin Bogner博士合作，她的團隊設計并評估了凍干LNPs的解決方案。這份凍干技術(shù)報告總結了網(wǎng)絡(luò )研討會(huì )。

我們還在下文為大家推薦了幾款國際大廠(chǎng)都在采用的進(jìn)口凍干機設備，以供參考。

凍干的挑戰

冷凍干燥過(guò)程中存在許多挑戰，其中一些是由于冷凍過(guò)程中冰的形成，會(huì )導致顆粒聚集或納米顆粒的結構損傷。所得到的餅形態(tài)在循環(huán)開(kāi)發(fā)過(guò)程中對特定的玻璃化轉變和塌陷溫度(分別為Tg’和Tc)也很敏感。即使在凍干燥工藝優(yōu)化后，也需要考慮重構時(shí)間，方便最終用戶(hù)給藥。

通過(guò)評估和優(yōu)化這些參數以及使用凍干保護劑，可以改善每種納米顆粒和藥物的凍干條件。理想情況下，最佳的凍干產(chǎn)品將表現出優(yōu)雅的餅狀形態(tài)，不會(huì )坍塌，保持納米顆粒的結構和藥物包封，含有低水分 (<2%) 可以長(cháng)期穩定，并在短時(shí)間內重構。

Lu博士研究了三種不同納米顆粒的冷凍干燥條件：

· 固體脂質(zhì)納米顆粒(SLNs)

· 聚合物納米顆粒(PNs)

· 脂質(zhì)體(Lipos)

在研究配方和冷凍條件對納米顆粒質(zhì)量的影響以及最終產(chǎn)品的長(cháng)期穩定性之前，用一系列凍干保護劑測定了三種納米顆粒的Tg’和Tc。

這些實(shí)驗采用帶ControLyo? 技術(shù)的SP LyoStar3冷凍干燥機，使冰成核得到控制，所有小瓶同時(shí)凍冷成核。

配方的影響

比較了三種凍干保護劑對凍干納米顆粒 (SLNs、PNs和Lipos) 的保存效果：

1. 蔗糖 (1：5和1：10)

2. 海藻糖 (1：5和1：10)

3. 甘露醇 (1：5和1：10)

添加任何一種保護劑都沒(méi)有導致蛋糕形態(tài)的顯著(zhù)變化， 在任何小瓶中都沒(méi)有產(chǎn)生合理的蛋糕。然而，有證據表明在一些小瓶中會(huì )收縮，特別是沒(méi)有凍干保護劑的脂質(zhì)體。

雖然凍干蛋糕的優(yōu)雅性相似，但通過(guò)添加凍干保護劑，大大減少了重構時(shí)間。在PNs中，甘露醇 (1：5和1：10) 將這次時(shí)間從35分鐘減少到5 min以下 (圖1)

圖1：添加凍干保護劑對重構時(shí)間的影響

我們還通過(guò)測量冷凍干燥前后的顆粒大小和均勻性 (多分散性指數，PDI) 來(lái)評估納米顆粒的成功凍干。凍干保護劑能保持SLNs和Lipos的顆粒大小，其中蔗糖和海藻糖比甘露醇更有效。在PNs中，添加或不添加凍干保護劑對顆粒大小影響不大。PNs配方中存在的聚乙烯醇(PVA)可能提供一定的聚集保護。蔗糖和海藻糖是保持顆粒大小和改善粒徑分布最有效的凍干保護劑。SLNs和Lipos需要凍干保護劑來(lái)維持尺寸分布，而PNs需要凍干保護劑來(lái)縮短重構時(shí)間。

凍結條件的影響

冷凍是凍干過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵步驟。由于不受控制的凍結 ，可能會(huì )出現許多問(wèn)題，如批次內冰晶大小的不均勻性， 以及由微小冰晶造成的更高的塌陷風(fēng)險。

ControLyo? 是一種控制成核的技術(shù)，實(shí)現更高的成核溫度，產(chǎn)生更大的晶體，從而加快初級干燥時(shí)間。

在本研究中，我們比較了不同冷凍條件對每種納米顆粒的影響。

1. 無(wú)控制的冰成核：冷卻速率為1℃/min至-40℃；

2. 快速凍結：將顆粒浸入液氮中，然后放入冷凍干燥機進(jìn)行干燥；

3. 慢速凍結：使用ControLyo?在-4℃，冷卻速度0.2℃/ min至-40℃；

4. 控制成核：使用ControLyo?在-4℃和-8℃控制冰成核，冷卻速率為1℃/min至-40℃。

在快速凍結條件下，所有產(chǎn)品均出現極嚴重的裂紋，不含凍干保護劑的 Lipos均發(fā)生塌陷。不受控制的冰成核也產(chǎn)生了顯著(zhù)的蛋糕收縮。慢速冷凍是唯一一種能同時(shí)增加含凍干保護劑的SLNs 和 Lipos 的粒徑和均勻性(PDI)的冷凍條件(圖2)。然而，慢速冷凍并不會(huì )影響PNs的粒徑或粒徑分布，可能是由于PVA的存在，如前所述。

圖2：冷凍條件的影響：結果—固體脂質(zhì)納米顆粒

冷凍條件也不影響所有納米顆粒的重構時(shí)間和剩余水分含量，盡管添加有效的冷凍保護劑降低了所有納米顆粒的這兩個(gè)參數。

無(wú)菌潔凈室的冰成核溫度一般較低，因為控制的環(huán)境符合ISO 5或A級分類(lèi)。

長(cháng)期穩定性

比較了不同的儲存條件，以確定納米顆粒的長(cháng)期穩定性。

1．液體配方在室溫 (RT)

2．液體配方在4℃

3．未控制冰成核的凍干產(chǎn)品在室溫(RT)

4．控制冰成核的凍干產(chǎn)品在室溫(RT)

在室溫（RT）下以液體形式儲存SLNs，在10天內顯著(zhù)增大了100%的粒徑(圖3)，并迅速提高了PDI。在4℃的冰箱中儲存SLNs稍微好一些，三個(gè)月時(shí)觀(guān)察到顆粒大小增加了100%。通過(guò)冷凍干燥，該納米顆粒的儲存得到了顯著(zhù)改善。而當使用Controlyo控制成核方法時(shí)，3個(gè)月后顆粒尺寸沒(méi)有變化。目前還沒(méi)有Lipos的數據。

圖3：不同冷凍干燥和儲存條件下SLNs的平均粒徑變化

相比之下，PNs的大小和均勻性不受任何存儲條件的顯著(zhù)影響，因為它們在所有條件下都相對穩定。

總結

在-4℃或-8℃下控制冰成核的冷凍干燥納米顆?？梢蕴峁└玫娘炐螒B(tài)而不塌陷，凍干保護劑能夠保存顆粒大小，改善顆粒均勻性，并縮短重建時(shí)間。然而，這些條件在不同的納米顆粒之間是不同的，所以單獨優(yōu)化每個(gè)產(chǎn)品是很重要的，而不是假設條件是可互換的。

由于冷凍干燥產(chǎn)品的主要原因是增加長(cháng)期穩定性和解決冷鏈運輸的難題，因此仔細評估每個(gè)納米顆粒的凍干條件最終將有利于許多藥物和疫苗產(chǎn)品的生產(chǎn)和儲存能力。

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