隨著(zhù)生物制藥的迅猛發(fā)展，凍干已經(jīng)成為一種有效的技術(shù)來(lái)解決制藥過(guò)程中存在的化學(xué)，物理，生物的不穩定性問(wèn)題。結合凍干本身的技術(shù)特點(diǎn)，凍干產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的目的是要保證產(chǎn)品質(zhì)量的同時(shí)利用更短的生產(chǎn)時(shí)間來(lái)節約成本。產(chǎn)品的質(zhì)量包括安全，高效，穩定，較短的復水時(shí)間，優(yōu)雅的蛋糕外觀(guān)等。

眾所周知，凍干是一個(gè)復雜的傳熱傳質(zhì)的過(guò)程，如果處理不當，在冷凍以及干燥過(guò)程中，樣品中的活性成分以及賦形劑會(huì )發(fā)生一些物理或化學(xué)變化，從而破壞了各自原有的功能特性，因此需要進(jìn)行采取合理的方法來(lái)加以解決，從而達到凍干制劑開(kāi)發(fā)的目的。

 預凍階段 

樣品溶液隨著(zhù)溫度的降低，含有的水先凍結成冰晶析出，剩余的溶液的濃度越來(lái)越大，形成最大濃縮凍結液，溶質(zhì)和溶劑分離，在這個(gè)階段，水分的結晶會(huì )導致蛋白濃度增加，賦形劑濃度增加，離子強度增加，粘度增加，賦形劑結晶或相分離，pH改變等，這些可能會(huì )影響到蛋白的穩定性。

 干燥 

結晶的冰通過(guò)升華去除，未結晶的冰通過(guò)解吸附去除，樣品中的水分含量是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，樣品會(huì )面臨水分去除產(chǎn)生的應力，即干燥應力，導致配方中成分發(fā)生一定的變化。

 儲存 

較低的水分含量，溫度的偏差，賦形劑的相分離。

常用賦形劑的功能性及物理狀態(tài)

表1：常用賦形劑的功能性及期望的物理狀態(tài)

然而在凍干過(guò)程中，活性成分以及賦形劑之間具有復雜的相互影響，不同的濃度，不同的比例，不同的種類(lèi)等都會(huì )引起一些結構狀態(tài)的變化，從而導致其原本的功能喪失，比如：若海藻糖結晶會(huì )導致保護功能的喪失；若甘露醇變?yōu)闊o(wú)定形結構，會(huì )降低產(chǎn)品的關(guān)鍵溫度，并且無(wú)定形態(tài)具有較差的穩定性，喪失了其作為填充劑的功能；若緩沖液成分結晶，會(huì )導致pH值的變化，緩沖功能喪失，蛋白穩定性受到影響。因此研究各個(gè)配方組分之間的相互影響作用對確保最終產(chǎn)品的質(zhì)量具有較大的作用。

 01.糖類(lèi)和填充劑功能性之間的相互影響 

雙糖是常用的凍干保護劑，如蔗糖，海藻糖，雙糖與蛋白的最小質(zhì)量比通常為3:1到5:1，但是糖類(lèi)通常會(huì )降低樣品的玻璃態(tài)轉化溫度，使得凍干通常會(huì )花費較長(cháng)的時(shí)間，因此會(huì )將糖類(lèi)跟具有較高共晶融化溫度的填充劑結合使用，如甘露醇，甘氨酸，這樣可以讓樣品在較高的溫度下進(jìn)行干燥，形成良好的外觀(guān)結構，節約干燥時(shí)間(Tang and Pikal, Pharm Res. 2004; Johnson, Kirchhoff and Gaud, J Pharm Sci. 2001)。

市面上有一些藥品就是以這種方式開(kāi)發(fā)的，如阿必魯泰（Tanzeum），是一種融合蛋白，糖尿病患者用藥，配方中含海藻糖以及甘露醇成分；沙格司亭凍干粉注射劑（Leukine）是一種源于酵母的重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（rhGM-CSF），能夠刺激各種免疫細胞的生長(cháng)和活化，已用于白血病患者降低感染風(fēng)險，配方中含蔗糖和甘露醇成分；魯磨西替（Lumoxiti）是一種單抗抗癌制劑，配方中含蔗糖和甘氨酸成分。

圖1：阿必魯泰（Tanzeum）

這種結合的有效性取決于：在凍干和儲存過(guò)程中兩種賦形劑的物理形態(tài)；正確的比例以及凍干條件。理想狀態(tài)下，整個(gè)過(guò)程中糖類(lèi)應當處于無(wú)定形狀態(tài)，起到穩定劑的作用；填充劑在干燥之前應當充分結晶，使得樣品具有良好的結構強度，提高關(guān)鍵產(chǎn)品溫度，縮短凍干時(shí)間。

 Part.1  蔗糖對甘氨酸填充劑結晶的抑制影響

實(shí)驗通過(guò)將蔗糖和甘氨酸以不同比例（從1:9到9:1）溶解于水中，分別在15℃退火1h 和不進(jìn)行退火，凍干后樣品通過(guò)近紅外光譜測定甘氨酸的結晶度。觀(guān)察到當蔗糖：甘氨酸＞4時(shí)，甘氨酸失去了其填充劑的功能（Bai et al., J Pharm. Sci. 2004）。

圖2：蔗糖對甘氨酸填充劑功能的影響

Figure plotted from data given in Bai et al., J PHarm. Sci. 2004

 Part.2  海藻糖+甘露醇功能性的相互影響

不同比例的海藻糖+甘露醇溶液進(jìn)行凍干，二者的比例決定了各自的物理形態(tài)以及其發(fā)揮的功能性（Jena, Suryanarayanan and Aksan, Pharm Res. 2016）。

表2：海藻糖和甘露醇比例對其物理形態(tài)及功能性影響

海藻糖在酸性條件下不會(huì )水解，具有較高的玻璃態(tài)轉變溫度，但是具有結晶傾向性。當凍干的條件利于海藻糖無(wú)定形形態(tài)存在時(shí)，會(huì )抑制甘露醇的結晶，相反，當凍干的條件利于甘露醇結晶形態(tài)存在時(shí)，會(huì )促進(jìn)海藻糖二水合物的產(chǎn)生，失去其無(wú)定形結構，二者相互抑制，因此需要確定理想的一個(gè)比例條件，確保各自能發(fā)揮本身應起的作用。從實(shí)驗結果來(lái)看，當海藻糖和甘露醇比例為1:3時(shí)，甘露醇保持其原有的晶體形態(tài)，海藻糖保持其原有的無(wú)定形態(tài)，在配方中分別起填充劑和穩定劑的功能（Sundaramurthi and Suryanarayanan, J. Phys. Chem. Letters 2010; Sundaramurthiet. al., Pharm. Res. 2010; Sundaramurthi and Suryanarayanan, Pharm. Res. 2010;）。

 Part.3  海藻糖、API（BSA）和甘露醇的相互影響

海藻糖—BSA---甘露醇凍干混合液，海藻糖和BSA的不同比例對海藻糖物理形態(tài)的影響，甘露醇濃度固定在10%W/W，總的固形物含量22%W/W（Jena et al., Int J. Pharm.2019）。

表3：BSA和海藻糖比例對海藻糖物理形態(tài)影響

實(shí)驗結果表明

當BSA與海藻糖比例為10:1時(shí)，海藻糖能起到良好的穩定劑作用。

 Part.4  蔗糖和甘露醇的相互影響

除了抑制作用外，糖可能會(huì )改變甘露醇的存在形式，甘露醇有幾種形態(tài)存在，無(wú)水甘露醇（α-，β-，δ-）和半水合物-MHH。研究發(fā)現當蔗糖：甘露醇為1:4時(shí)，蔗糖會(huì )保留無(wú)定形態(tài)，甘露醇為結晶態(tài)（部分以MHH形式存在），MHH甘露醇在最終的干燥產(chǎn)品中是不希望存在的，在儲存的過(guò)程中，MHH會(huì )脫水，釋放水分，水分可能會(huì )跟產(chǎn)品中的其他組分進(jìn)行反應，無(wú)定形狀態(tài)的蔗糖吸收水分后會(huì )發(fā)生結晶，從而失去了對活性成分的保護功能（Thakral, Sonjeand Suryanarayanan, Int J. Pharm. 2020）。

因此，綜上所述，開(kāi)發(fā)穩定的凍干產(chǎn)品配方，并達到期望的產(chǎn)品質(zhì)量屬性，需要正確地選擇賦形劑的濃度，包括糖與填充劑的比例，蛋白與糖的比例，并且需要對凍干條件進(jìn)行優(yōu)化。

 02.API/賦形劑對緩沖液功能性的影響 

緩沖液需要加入到溶液中進(jìn)行pH的控制。常見(jiàn)的緩沖液包括磷酸鈉緩沖液，磷酸鉀緩沖液，組氨酸緩沖液，tris 緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，琥珀酸鹽緩沖液等。凍干產(chǎn)品緩沖液的選擇需要考慮蛋白的pKa以及緩沖液組分的結晶傾向，如磷酸鈉緩沖液中，酸性的磷酸二氫一鈉是無(wú)定形態(tài)；堿性的磷酸氫二鈉在凍結過(guò)程中會(huì )結晶成Na?HPO?·12H?O，導致凍結濃縮液的pH降低，失去了緩沖液的功能，因此緩沖液成分的結晶往往是不期望的。

 Part.1  緩沖液，蛋白，糖之間的相互影響

有實(shí)驗研究了10mM 磷酸鈉緩沖液，100mM 磷酸鈉緩沖液，含5% w/w的纖維二糖，纖維二糖，在低pH下不會(huì )水解，不會(huì )結晶（通過(guò)在凍結過(guò)程中測定其pH值以及使用原位X射線(xiàn)衍射儀對結晶組分進(jìn)行鑒定）以及100mM 磷酸鉀緩沖液三種緩沖液與纖維二糖，蛋白之間的相互影響，如下表所示（Thorat, Munjal, Geders and Suryanarayanan, J. Control Rel.2020）——

表4：緩沖液、糖及蛋白成分對pH變化的影響

樣品中活性成分蛋白、糖與緩沖液之間具有協(xié)同作用，蛋白可以抑制緩沖液結晶，使其保持無(wú)定形狀態(tài)，緩沖液反過(guò)來(lái)可以維持特定的pH值，增加蛋白的穩定性；一定濃度的糖可以抑制緩沖液的結晶，保持其無(wú)定形態(tài)，從而維持特定的pH值，提高蛋白穩定性。

 Part.2  甘氨酸對磷酸鈉緩沖液結晶以及pH變化的影響

表5：甘氨酸對磷酸鈉緩沖液結晶以及pH變化的影響

在10 mM緩沖液中，甘氨酸濃度越高，pH值變化越明顯，另外通過(guò)用同步X射線(xiàn)衍射法監測溶質(zhì)結晶程度，磷酸鹽緩沖液對甘氨酸結晶具有濃度依賴(lài)性抑制作用，20%W/V甘氨酸和50-200mM緩沖液，緩沖液濃度越高，抑制作用越強，并且在-20℃進(jìn)行退火處理，能夠增強甘氨酸的結晶度。pH的改變能夠引起蛋白凝聚，可以通過(guò)降低緩沖液濃度，使用不結晶的緩沖液，通過(guò)蛋白，糖來(lái)抑制緩沖液結晶，并且某些蛋白本身就具有pH緩沖的功能（Pikal-Cleland et al., J. Pharm. Sci. 2002；Varshney et al., Pharm. Res. 2007；Thorat, Munjal, Geders and Suryanarayanan, J. Control Rel. 2020; Sundarmurathi and Suryanarayanan, J. Phys. Chem. B. 2011; Gokarnet al., J. Pharm. Sci. 2008）。

 03.總結 

凍干配方成分之間具有復雜的相互作用，某些組分可以通過(guò)改變其他組分的相行為來(lái)影響其功能性，必須正確選擇配方中賦形劑的濃度，使得每種成分能夠維持其理想的物理形態(tài)，發(fā)揮應有的功能性。

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