近年來(lái)，我國IVD產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，國內市場(chǎng)容量向千億元級邁進(jìn)。

分子診斷作為體外診斷（IVD）領(lǐng)域發(fā)展很快的細分行業(yè)，具有檢測時(shí)間短、靈敏度更高、特異性更強等優(yōu)勢，被廣泛應用于傳染性疾病、血液篩查、遺傳性疾病、腫瘤伴隨診斷等領(lǐng)域。

1、分子診斷技術(shù)

分子診斷是指以DNA和RNA核酸為診斷材料，使用分子生物學(xué)技術(shù)檢測人體是否攜帶病毒基因、是否存在缺陷基因以及是否存在表達異常。 分子診斷是預測診斷的主要方法，既可以實(shí)現個(gè)體遺傳病的診斷，又可以實(shí)現腫瘤早篩。

分子診斷大致可分為PCR技術(shù)、基因測序、熒光原位雜交和基因芯片等。

                               圖1：分子診斷技術(shù)的分類(lèi)

目前國內分子診斷細分賽道市場(chǎng)份額占比分別為：PCR(40%)，分子雜交（35%），生物芯片（16%），其他（9%），PCR技術(shù)占據了分子診斷半壁江山。

（根據智研咨詢(xún)/國元證券研究中心數據調研）

肆虐全球的新冠疫情是分子診斷行業(yè)發(fā)展的催化劑，而PCR技術(shù)是分子診斷中很常用的檢測手段，作為確診新冠的“金標準”。

2、PCR聚合酶鏈式反應

PCR（Ploymerase chain reaction）,即聚合酶鏈式反應的縮寫(xiě)，一種核酸（DNA或RNA）體外擴增技術(shù)。利用DNA雙鏈復制的原理，能在短時(shí)間內將及微量的特定核酸片段復制出百萬(wàn)份的拷貝，從而實(shí)現對極其微量的DNA或RNA片段進(jìn)行定量。

                                    圖2：PCR反應過(guò)程

PCR技術(shù)由1983年Kary Mullis首創(chuàng )，被廣泛運用在產(chǎn)前診斷（如乙肝病毒篩查）、腫瘤早篩（如HPV人乳頭瘤病毒檢測）、傳染病檢測（如HIV艾滋病病毒檢測）、呼吸疾病檢測（新型冠狀病毒）基因檢測(如親子鑒定)等診斷。

                                     圖3：核酸檢測案例

體外診斷RT-PCR試劑盒中包含了模板雙鏈DNA、一對特定序列的引物、一個(gè)帶有檢測基因的探針、DNA聚合酶、底物dNTP、緩沖溶液等，那么如何確保DNA能順利進(jìn)行特異性擴增？又如何正常標記？引物和探針的寡核苷酸原料必不可少。

                                  圖4：PCR反應試劑原料

引物和探針的寡核苷酸原料必不可少。

上文提及的引物、探針，和酶等都是IVD原料，即用于制備IVD產(chǎn)品的材料，其品質(zhì)對IVD產(chǎn)品的性能和檢測準確度影響極大，因此上游環(huán)節在IVD產(chǎn)業(yè)鏈中話(huà)語(yǔ)權極強。

然而，長(cháng)期以來(lái)IVD原料生產(chǎn)一直是我國IVD產(chǎn)業(yè)中的卡脖子環(huán)節。IVD原料市場(chǎng)需求不斷增長(cháng)，但其背后的核心技術(shù)并未取得相同幅度的進(jìn)步。由于IVD原料的研發(fā)難度較高，國產(chǎn)IVD原料在生產(chǎn)工藝及純度質(zhì)量上仍與進(jìn)口原料存有差距。

隨著(zhù)我國IVD原料企業(yè)投入大量資金開(kāi)展基礎研究與開(kāi)發(fā)工作，其研發(fā)創(chuàng )新能力與原料工藝質(zhì)量不斷提升。那么我們先來(lái)了解一下，生產(chǎn)這些上游原料的要點(diǎn)及難點(diǎn)。

引物

引物的特異性是PCR特異性的關(guān)鍵，引物是具有獨特靶向序列的短鏈寡核苷酸片段，幫助識別基因組的獨特性。通過(guò)引物特異性結合在目標區域，作為DNA復制開(kāi)始時(shí)DNA聚合酶的結合位點(diǎn)。不純的引物不但會(huì )直接影響RT-PCR的特異性和定量不準，還會(huì )影響后續的測序實(shí)驗。

引物不純可能會(huì )導致：

1)非特異性擴增；

2)無(wú)法用預先設計在引物5′端酶切位點(diǎn)的酶切開(kāi)，特別是沒(méi)有保護堿基的引物；

3) 用于測序出現雙峰或亂峰。

                                          圖5：引物

探針

TaqMan熒光探針是一種具有熒光基團的特定寡核苷酸片段，通過(guò)檢測熒光分子的信號強度即可知道PCR產(chǎn)物擴增量，每擴增一條DNA子鏈，就有一個(gè)熒光分子發(fā)出信號。

                                    圖6：Taqman探針

無(wú)論是PCR反應還是NGS測序等核酸水平的分子診斷技術(shù)，都需要優(yōu)質(zhì)的引物和探針，確保診斷的靈敏度和準確性。必須對合成后的寡核苷酸片段進(jìn)行純化處理，得到符合純度要求的PCR試劑盒的原料，再銷(xiāo)售至下游生產(chǎn)核酸試劑盒的廠(chǎng)家。

3、如何得到優(yōu)質(zhì)或高純度的引物探針？

引物/探針等寡核苷酸通過(guò)自動(dòng)核酸合成儀合成之后，需要通過(guò)不同的分離純化方式（比如脫鹽過(guò)柱法或RP-HPLC方法）。

                                      圖7：HPLC純化 

RP-HPLC制備型反向高效液相色譜法是引物/探針常用的純化方法之一，其優(yōu)點(diǎn)是純度高（高達99%）、自動(dòng)化程度高。純化后需要使用相關(guān)的溶劑蒸發(fā)設備去除其有機溶劑（如乙腈、甲醇、水等）后，一般包裝至EP管或者96孔板中。

然而，使用傳統濃縮方法去除這些溶劑時(shí)，如果控制不當，未必能使溶劑蒸發(fā)完全，會(huì )影響引物和探針的一致性和純度。

為防止樣品暴沸，需要在溶劑蒸發(fā)過(guò)程的控制好抽真空速率，Genevac大容量核酸合成濃縮儀（圖7）利用控制真空度和離心力，可以有效防止暴沸避免交叉污染。

                                  圖8：真空離心濃縮儀  

4、爭分奪秒|分子診斷的新趨勢

隨著(zhù)核酸檢測常態(tài)化發(fā)展，大量的新冠試劑盒被用于每日的核酸檢測。分子診斷新趨勢是更快，更準！ 

采樣快速——5月9日，國務(wù)院聯(lián)防聯(lián)控機制提出，大城市要建立步行15分鐘核酸“采樣圈”。

檢測快速——截至5月12日，上海市的核酸檢測能力現在也達到了每天800萬(wàn)管以上。

(數據來(lái)源：央視新聞)

5、為上海市復工復產(chǎn)做準備

按照六月以后復工復產(chǎn)的要求，每人每周需要進(jìn)行兩次的核酸檢測，根據上海市常住人口數量2500萬(wàn)，除去退休人員，小孩子，無(wú)業(yè)人員，至少有60%的人員需要參加這些檢測，也就是說(shuō)每天至少消耗越428萬(wàn)管的檢測試劑。

面對日均如此大需求量的檢測試劑盒，上游原材料的質(zhì)量和供應速度應該同幅度進(jìn)步和增長(cháng)，在引物和探針的制備過(guò)程中，使用高通量的真空離心濃縮設備可以大幅度提高生產(chǎn)效率，溶劑蒸發(fā)的速度起到四兩撥千斤的作用。

接下來(lái)介紹一款大容量核酸合成濃縮儀miVac Quattro，它的樣品通量是傳統的氮吹濃縮儀的5倍+，大幅度提高了蒸發(fā)容量和節約蒸發(fā)時(shí)間。在核酸合成中常用的1.5ml EP管可以同時(shí)濃縮200位樣品，另外兼容96孔板，最多可同時(shí)容納20個(gè)淺孔微孔板或8個(gè)深孔板。

                            圖9：miVac Quattro大容量核酸合成濃縮儀

                           圖10： 多樣的轉子類(lèi)型

提高濃縮速度的秘訣是提高熱傳導率。

下圖使用不同條件下的樣品濃縮速度，Genevac通過(guò)一系列措施促進(jìn)熱量向樣品傳導，在濃縮速度上有顯著(zhù)提升，助力引物/探針試劑高效率生產(chǎn)。

                   圖11：不同條件下的提升濃縮速度

①實(shí)心鋁制轉子——相比塑料轉子或空心轉子，獨特的實(shí)心鋁制轉子具有良好的熱傳導效果，即使在真空條件下也能有效傳遞熱量。

②腔體預熱功能——結合腔體預熱功能，能有效提升濃縮速度。

③高效率的SpeedTrap?冷阱——新型的冷阱線(xiàn)圈制冷，能冷凝回收95%以上的有機溶劑。

                                圖12：Speedtrap冷阱

一款安全、可控、快速、高通量的濃縮儀，可以更大程度地減輕工作負擔，高效助力生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的IDV原料，用戶(hù)僅需設置溫度，一鍵選擇醇或水的方法，然后按下啟動(dòng)鍵即可使用。 

寡核苷酸除了在IVD中扮演重要角色，現在作為創(chuàng )新藥的熱門(mén)選手，也承載了很多科研人員的希望，下一期我們就來(lái)聊聊Oligo藥物篩選的那些事。

原理介紹：

Genevac miVac是由離心腔、冷阱、真空泵三部分組成真空離心濃縮儀，用于對寡核苷酸、核酸等樣品進(jìn)行濃縮、純化、干燥，適用于oligo合成、RNA/DNA制備、肽制備、測序、分子生物學(xué)和ADME/毒理學(xué)研究。

抽真空：利用壓力降低時(shí)，溶劑的沸點(diǎn)也隨著(zhù)降低。使生物樣品能在較低的溫度條件下進(jìn)行溶劑蒸發(fā)。加快蒸發(fā)效率的同時(shí)，可防止熱敏感樣品失活。

離心：為了避免樣品暴沸和交叉污染，采用高速離心旋轉技術(shù)，離心力的作用下可以有效防止暴沸和樣品損失，干燥后的溶質(zhì)完全沉積在容器的底部，便于樣品的完全回收。

熱量：加速樣品的蒸發(fā)速率。

英國GeneVac公司成立于1990 年，隸屬SP Scientific 旗下，一直專(zhuān)注于研究和生產(chǎn)各種離心蒸發(fā)濃縮設備，不斷為生命科學(xué)提供更前沿和優(yōu)質(zhì)的解決方案。